Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP “Dr. Antônio Guilherme de Souza” Instituto Butantan Izabella de Macedo Henrique Cultivos em meios complexos para produção de L-asparaginase em Escherichia coli BL21(DE3) São Paulo 2020 Izabella de Macedo Henrique Cultivos em meios complexos para produção de L-asparaginase em Escherichia coli BL21(DE3) Trabalho de conclusão de curso de especialização apresentado ao Instituto Butantan, unidade do Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP “Doutor Antônio Guilherme de Souza”, como requisito parcial para a obtenção do título de Especialista em Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos. Orientador (a): Dra. Mickie Takagi São Paulo 2020 Dados internacionais de catalogação-na-publicação Ficha catalográfica elaborada pelo aluno a partir do modelo desenvolvido pela Biblioteca do Instituto Butantan Henrique, Izabella de Macedo Cultivos em meios complexos para produção de L-asparaginase em Escherichia coli BL21(DE3)/ Izabella de Macedo Henrique; orientador Mickie Takagi. – São Paulo, 2020. 60 f.: il. Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização) – Secretaria de Estado da Saúde, Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP “Doutor Antônio Guilherme de Souza” desenvolvido no Instituto Butantan para o Curso de Especialização em Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos. 1. Cultivo bacteriano. 2. Bioprocessos. 3. Biotecnologia. I. Takagi, Mickie. II. Instituto Butantan. III. Curso de Especialização em Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos. IV. Cultivos em meios complexos para produção de L- asparaginase em Escherichia coli BL21(DE3). AUTORIZAÇÃO PARA ACESSO E REPRODUÇÃO DE TRABALHO Eu, Izabella de Macedo Henrique, aluno(a) do curso Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos, autorizo a divulgação do meu trabalho de conclusão de curso por mídia impressa, eletrônica ou qualquer outra, assim como a reprodução total deste trabalho de conclusão de curso após publicação, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte. Prazo de liberação da divulgação do trabalho de conclusão de curso após a data da avaliação: (X) Imediato ( ) 06 meses ( ) 12 meses ( ) Outro prazo ____________ Justifique: São Paulo, 30 de Janeiro de 2020 aluno(a): De acordo: Orientador(a): Dra. Mickie Takagi Dedico esse trabalho a meus pais por todo o apoio e carinho durante esta jornada. Ao meu namorado por todo suporte e amor. AGRADECIMENTOS À minha orientadora Dra. Mickie Takagi pelo auxilio e cuidado durante a produção deste trabalho. Toda a equipe do laboratório de Desenvolvimento de Processos do Instituto Butantan que me acolheu e auxiliou durante o projeto. Este trabalho teve apoio financeiro da Secretaria da Saúde do Governo do Estado de São Paulo. “Todo mundo é um gênio. Mas, se você julgar um peixe por sua capacidade de subir em uma árvore, ele vai gastar toda a sua vida acreditando que é estúpido.” Albert Einstein RESUMO Henrique, Izabella de Macedo. Avaliação de parâmetros de cultivo para produção de L-asparaginase por Escherichia coli BL21(DE3). 2020. Trabalho de Conclusão de Curso Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos – Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP; Instituto Butantan, São Paulo, 2020. A Leucemia linfoide aguda (LLA) é um tipo de neoplasia que tem como tratamento altamente eficaz a L-asparaginase. Este biofármaco cliva a asparagina e libera amônio e ácido aspártico; as células neoplásicas que não produzem asparagina devido a sua maquinaria celular ainda imatura acabam morrendo na ausência desse aminoácido. No Brasil, os pacientes têm dificuldade no acesso a esse medicamento por ser importada, de alto custo, além de problemas no fornecimento. Assim, um grupo de pesquisadores buscam desenvolver um medicamento nacional, com menor potencial alérgico, para que o país tenha autonomia, possibilitando o acesso à população através do SUS. A Escherichia coli BL21(DE3) tem sido amplamente utilizada para a expressão de proteínas heterólogas e possibilitar o aumento da densidade celular. Este trabalho consiste em avaliar diferentes meios complexos, os micronutrientes e indutor apropriado para a produção de L-asparaginase recombinante. E.coli BL21(DE3) contendo o vetor de expressão pET28a, com promotor T7, marcador de seleção para Canamicina e carregando a sequência de gene KY305877 foi utilizada. Experimentos em fracos agitados foram realizados a 300 rpm, 37°C em: Luria Bertani (LB), Semi Definido (SD), Super Broth (SB), Terrific Broth (TB), TB mod., TB mod. + nutrientes, TB mod. em diferentes fontes de carbono, TB mod. em lactose como indutor. Foram ainda realizados ensaios em biorreator com o meio TB modificado. Amostras foram coletadas a cada hora para análise de biomassa, atividade enzimática e eletroforese. O meio TB apresentou a maior DO600nm e atividade enzimática. A triptona do meio TB foi substituída por soytone, um componente de origem vegetal, e ajustada na sua quantidade (17 g/L) para atingir valores similares em crescimento e atividade da asparaginase obtida com a triptona originando o meio TB mod. Nesta composição não houve a necessidade de suplementação de micronutrientes. A incrementação do meio TB mod. com glicose, glicerol e lactose, sendo a lactose atuando também como indutor, apresentou atividade enzimática promissor em frascos agitados de 5 UI/Lcultivo mediante a 6UI/Lcultivo com IPTG. O uso IPTG é inadequado devido ao custo elevado, toxicidade e limitação no monitoramento durante o cultivo, por outro lado a lactose poderá ser introduzida na formulação do meio juntamente com demais componentes e atuará como indutor quando a glicose acabar e como fonte de carbono. Este tipo de meio é conhecido como meio de auto-indução. Em biorreator a DO600nm chegou a 39,9 UA com atividade enzimática de 29 UI/Lcultivo. Palavras-chave: L-asparaginase. Escherichia coli BL21(DE3). Leucemia linfoide aguda. Meio complexo. ABSTRACT HENRIQUE, Izabella de Macedo. Evaluation of bacterial growth parameters for the production of L-asparaginase by Escherichia coli BL21 (DE3). 2020. xx p. Monograph Biotechnology for health: Vaccines and Biopharmaceuticals – Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP; Instituto Butantan, São Paulo, 2020. Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is a type of neoplasia that has L-asparaginase as a highly effective treatment. This biopharmaceutical cleaves asparagine and releases ammonium and aspartic acid; this neoplastic cells do not produce asparagine due to their still immature cellular machinery and end up dying in the absence of that amino acid. In Brazil, patients have difficulty in accessing this medicine because it is imported, has a high cost, in addition to problems in supply. Therefore, a group of researchers seeks to develop a national drug, with less allergic potential, therefrom the country will have autonomy, enabling access to the population through SUS. Escherichia coli BL21 (DE3) has been widely used for the expression of heterologous proteins and to reach a high cell density. This work consists of evaluating different complex media, micronutrients and appropriate inducer for the production of recombinant L-asparaginase. For this study was used E.coli BL21 (DE3) containing the expression vector pET28a, with T7 promoter, selection marker for kanamycin and carrying the KY305877 gene sequence. Experiments in stirred flask were performed at 300 rpm, 37 ° C in: Luria Bertani (LB), Semi Defined (SD), Super Broth (SB), Terrific Broth (TB), TB mod., TB mod. + nutrients, TB mod. in different carbon sources, TB mod. in lactose as an inducer. Bioreactor tests were also carried out with the modified TB medium. Samples were collected every hour for analysis of biomass, enzymatic activity and electrophoresis. The TB medium showed the highest DO600nm and enzymatic activity. The tryptone of the TB medium was replaced by soytone, a component of plant origin, and adjusted in its concentration (17 g / L) to achieve similar values in growth and asparaginase activity obtained with the tryptone originating the TB mod medium. In this composition there was no need for micronutrient supplementation. The increment of the TB medium mod. with glucose, glycerol and lactose, with lactose also acting as an inducer, showed promising enzymatic activity in stirred flasks of 5 IU / ml of culture through 6UI / ml of culture with IPTG. The use of IPTG is inappropriate due to the high cost, toxicity and limited monitoring during cultivation, on the other hand, lactose may be introduced in the formulation of the medium together with other components and will act as an inducer, when the glucose runs out, and as a carbon source. This type of medium is known as a self-inducing medium. In a bioreactor the DO600nm reached 39.9 AU with enzymatic activity of 29 IU / Cultivation. Keywords: L-asparaginase. Escherichia coli BL21(DE3). Acute Lymphoblastic Leukemia. Complex media. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figuras Figura 1- Infiltração da LLA na Corrente Sanguínea ................................................ 17 Figura 2- Indução IPTG ............................................................................................ 19 Figura 3- Reação enzimática .................................................................................... 27 Figura 4- Revelação da atividade enzimática por Nesslerização ............................. 28 Figura 5- SDS-PAGE cultivos em biorreator ............................................................. 43 Gráficos Gráfico 1- Perfil de crescimento de diferentes meios complexos ............................. 32 Gráfico 2-Cinética com diferentes concentrações de glicose e glicerol. ................... 37 Gráfico 3- Perfil de crescimento bacteriano na presença de glicose, glicerol e glicerol+glicose .......................................................................................................... 38 Gráfico 4- Avaliação de indutores. A- Perfil de crescimento bacteriano em presença de lactose. B- Perfil de crescimento bacteriano em presença de IPTG 1 mM comparado a Lactose 3 g/L e atividade enzimática representada (colunas). ............ 39 Gráfico 5- Parâmetros cinéticos do cultivo em batelada de Escherichia coli BL21(DE3) pET28 ASNase ....................................................................................... 41 Gráfico 6- Parâmetros cinéticos do cultivo em batelada alimentada de Escherichia coli BL21(DE3) pET28 ASNase ................................................................................. 42 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Composição dos diferentes meios de cultura utilizados ........................... 24 Tabela 2- Teste de avaliação em crescimento celular do meio TB modificado na presença dos micronutrientes ................................................................................... 25 Tabela 3- Custo dos Indutores .................................................................................. 30 Tabela 4- Atividade enzimática em diferentes meios complexos - indução com IPTG 1mM .......................................................................................................................... 33 Tabela 5- Comparação dos parâmetros cinéticos obtidos utilizando Triptona (origem animal) e Soytone (origem vegetal) ........................................................................... 34 Tabela 6- Tabela de análise química Soytone .......................................................... 35 Tabela 7- Comparação dos parâmetros cinéticos obtidos utilizando Triptona (origem animal) e Soytone enriquecido (origem vegetal) ....................................................... 35 Tabela 8- Modificações do meio TB .......................................................................... 36 Tabela 9- Comparação de custo dos indutores por litro de cultivo ........................... 40 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15 1.1 Revisão bibliográfica ........................................................................................ 16 1.1.1 Leucemia Linfoide Aguda .......................................................................... 16 1.1.2 Cenário Brasileiro em relação a L-Asparaginase ...................................... 17 1.1.3 Microorganismos geneticamente modificados........................................... 18 1.1.4 Meio de Cultivo e nutrição bacteriana ....................................................... 19 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21 3 METODOLOGIA .................................................................................................... 22 3.1 Microrganismo ................................................................................................... 22 3.2 Banco de trabalho de células bacterianas ...................................................... 22 3.3 Inóculo ................................................................................................................ 22 3.4 Cultivo ................................................................................................................ 23 3.5 Expressão da proteína de interesse em frascos agitados ............................. 23 3.6 Meios de Cultivo ................................................................................................ 23 3.7 Enriquecimento do meio TB modificado ......................................................... 24 3.8 Avaliação da fonte de carbono......................................................................... 25 3.9 Avaliação dos Indutores ................................................................................... 25 3.10 Cultivo em Biorreator ...................................................................................... 26 3.11 Procedimentos analíticos ............................................................................... 26 3.11.1 Densidade Celular ................................................................................... 26 3.11.2 Rompimento celular ................................................................................ 27 3.11.3 Determinação da atividade enzimática .................................................... 27 3.11.4 Determinação de massa seca ................................................................. 28 3.11.5 Análise de carboidratos e acetato ........................................................... 28 3.11.6 Eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ................................. 29 3.12 Velocidade específica máxima de crescimento ............................................ 29 3.13 Análise de custos - indutores......................................................................... 30 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 31 4.1 Avaliação dos meios complexos ..................................................................... 31 4.2 Avaliação de peptona de origem vegetal e micronutrientes no meio TB ..... 33 4.3 Avaliação das fontes de carbono..................................................................... 36 4.4 Avaliação dos indutores ................................................................................... 38 4.5 Cultivo em Biorreator ........................................................................................ 40 5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 44 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 45 ANEXOS ................................................................................................................... 49 15 1 INTRODUÇÃO O câncer é uma patologia que aflige e assusta a humanidade há tempos, sendo que achados históricos indicam que os primeiros relatos datam da era pré- histórica (FAGUET, 2014, p. 2022). Essa patologia se inicia a partir de uma mutação genética irreversível e evolui devido à reprodução indiferenciada e descontrolada dessas células mutadas, que são denominadas como neoplásicas (VANPUTTE et al., 2016). De acordo com a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) as neoplasias são a segunda principal causa de morte no mundo, tendo feito 9,6 milhões vítimas em 2018 e dessas a maior concentração de casos são em países de baixa e média renda (PAHO, 2018). Durante os últimos séculos os índices de incidência dessa doença aumentaram, pois, os principais fatores de risco estão ligados inerentemente ao estilo de vida moderna da humanidade sendo eles: alto índice de massa corporal, baixo consumo de frutas e vegetais, falta de atividade física, poluição atmosférica, uso de álcool e tabaco (PAHO, 2018). Em virtude de descobrir como prevenir e combater o câncer em 40 anos o Instituto nacional de Câncer dos Estados Unidos da América já gastou cerca de 90 Bilhões de dólares em pesquisa (SLATE MAGAZINE, 2013). O câncer pediátrico mais comum é a Leucemia Linfoide Aguda (LLA), nessa neoplasia as células atingidas são os linfócitos jovens que por sua vez após ocuparem a medula óssea, onde são sintetizados, inundam a corrente sanguínea (SILVA, 2009). É um câncer agressivo e o tratamento terapêutico é realizado pela quimioterapia em conjunto com uma combinação de drogas que almejam provocar a remissão total da doença (SANTOS, 2017). Um desses medicamentos é a L-Asparaginase II (ASNase), altamente eficaz para remissão da LLA. Sendo que após sua introdução as taxas de remissão da doença se tornaram maiores que 90% nos pacientes infantes (ELSPAR, 2019). Infelizmente desde 2013, o Brasil tem tido complicações para obter o biofármaco devido à perda do registro sanitário do único laboratório que fornecia Asnase para território nacional. Complicações surgiram por vezes relativo ao alto custo que tem uma droga importada e devido a não aceitação de um medicamento feito por farmacêuticas que não eram anteriormente utilizados nos protocolos terapêuticos no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). 16 Devido ao árduo processo de obtenção desse fármaco, o desenvolvimento de um método de produção brasileiro significa alcançar autonomia nacional em relação a essa problemática. Assim todos os pacientes terão acesso ao medicamento quando necessário. Por isso em 2014 foi criado um projeto temático, do qual o Instituto Butantan participa, e tem como propósito otimizar a produção e purificação da Asnase (FCP-USP, 2014). Em concordância com o objetivo institucional esse projeto visa melhorar a produção de Escherichia coli BL21(DE3) em ordem quantitativa por meio de análise de meios de cultivo complexos. 1.1 Revisão bibliográfica 1.1.1 Leucemia Linfoide Aguda A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é o câncer pediátrico mais comum, sendo contabilizados em 2018 um total de 10.800 casos de leucemia no Brasil (INCA, 2018). A maior incidência é entre pacientes com idade de 2 a 5 anos, do sexo masculino e caucasianos (SILVA, 2009). A Leucemia é uma neoplasia que afeta a corrente sanguínea e se origina na Medula Óssea. É conhecido que existem mais de 12 tipos de leucemia sendo a LLA um tipo agressivo, devido a isso é de grande importância o tratamento precoce (INCA, 2018; SILVA, 2009). A leucemia linfóide aguda é proveniente da proliferação descontrolada de linfoblastos que nessa patologia irão corresponder a mais de 20 % da população de células da medula óssea (CAVALCANTE, ROSA E TORRES, 2017). Com o acúmulo de linfoblastos, que são linfócitos jovens, na medula óssea o organismo sofre algumas perturbações como a infiltração dos blastos na corrente sanguínea (Figura 1) e o comprometimento da síntese de outras células do sistema hematopoiético (CAVALCANTE, ROSA E TORRES, 2017). Na Figura 1 é possível verificar como é a população celular do sangue de um paciente saudável em comparação com um paciente com LLA. Resultando na diminuição de outras linhagens de células (como hemácias, plaquetas, neutrófilos) e culminado em sintomas como fraqueza, anemia, comprometimento do sistema imune e hemorragias (CAVALCANTE, ROSA E TORRES, 2017). 17 Figura 1- Infiltração da LLA na Corrente Sanguínea Fonte: VBI VACCINES (2017). O diagnóstico é dado por técnicas de imunofitotipagem, citogenética/molecular e citoquímica (por meio da histologia da lâmina sanguínea). O protocolo terapêutico foi realizado pelo Grupo Brasileiro Cooperativo para tratamento de Leucemia na Infância (GBTLI). Foi normalizado como tratamento quimioterapêuticos em conjunto com uma combinação de drogas que almejam provocar a remissão total da doença (CAVALCANTE, ROSA E TORRES, 2017). As drogas são utilizadas em diferentes etapas do tratamento sendo a primeira dessas a indução da remissão, um medicamento essencial nessa etapa é L- Asparaginase II (CAVALCANTE, ROSA E TORRES, 2017). 1.1.2 Cenário Brasileiro em relação a L-Asparaginase No Brasil os hospitais realizavam a compra de L-Asparaginase II diretamente com o produtor, sendo esse o laboratório Bagó, qual era o único que possuía o registro sanitário nacional para comercialização do medicamento. Infelizmente em 2012 a farmacêutica Lundeck anunciou a descontinuação do medicamento ELSPAR, essa por sua vez era fornecedora do laboratório Bagó que devido a isso perdeu o registro sanitário em dezembro de 2012 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). Então os hospitais começaram a enfrentar dificuldades para ter acesso ao medicamento e devido a essa crise de obtenção em janeiro de 2013 a Sociedade Brasileira de Oncologia Pediátrica (SOBOPE) pede ao Ministério da Saúde (MS) a importação do medicamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). 18 No intuito de remediar a crise em maio de 2013 o Ministério da saúde faz a compra de Aginase, medicamento então comercializado pela Bagó que ainda não possuía registro sanitário, com o valor 369% maior do que estabelecido pela Câmara de Regulação do Mercado de Medicamentos (CMED). Em janeiro de 2017 é realizada licitação em caráter excepcional onde ocorre a compra do medicamento Leuginase/Beijing garantindo o estoque da droga até junho de 2017 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). Há certa resistência da comunidade médica para utilizar o medicamento devido ao hábito e segurança contido na droga anteriormente utilizada. Em janeiro de 2018 o Ministério de saúde voltou a considerar responsabilidade dos próprios hospitais oncológicos de adquirirem a ASNase, isso devido a um registro cedido a ONCOSPAR que possibilitava o comércio da droga no Brasil. Porém o fato da discrepância entre o valor cedido pelo MS para aquisição do tratamento e o custo do mercado interno era discrepante (G1TRIÂNGULO MINEIRO, 2019). Em 2014 o Prof Dr Adalberto Pessoa Junior da Faculdade de Ciências Farmacêutica - Universidade de São Paulo deu início ao projeto temático de L- Asparaginase com a colaboração de vários pesquisadores do Brasil e do Mundo e em 2018 o Instituto Butantan se integrou a este grupo para submeter o segundo temático, direcionado a produção e purificação propriamente dita nos moldes de produzir um biofármaco L-asparaginase (FCP-USP, 2014). 1.1.3 Microorganismos geneticamente modificados O primeiro microorganismo geneticamente modificado (OGM) surgiu na década de setenta com a inserção do gene responsável pela síntese de insulina em uma bactéria, a Escherichia coli. Através da sequência dos aminoácidos da insulina foi sintetizado o gene sintético da insulina humana, que foi incorporado em um vetor de expressão e então esse foi inserido na Escherichia coli (BOREM, SANTOS, 2008). Para que aconteça a expressão da proteína é necessário saber as informações genéticas responsáveis pela mesma, esse gene fará parte de um vetor de expressão que permite a secreção proteica (USP E-DISCIPLINAS, 2018). 19 No vetor está presente um sistema de expressão, sendo o mais conhecido o Operon Lac, através dele é possível regular a expressão de proteínas, sua ativação ocorre com a presença de lactose no meio (o que causa a indução da transcrição) e sem ela esse sistema é reprimido (JACOB, MONOD, 1965). Um indutor geralmente utilizado é o IPTG, esse é um análogo artificial a lactose, seu benefício é que por não ser metabolizado não há diminuição da sua concentração ao longo do cultivo (BANEYX, 1999). Na figura 2 é exibido como o IPTG age ao não permitir que o Lac repressor se ligue a região do operador, assim a região promotora fica livre para realizar ligações, sendo que para transcrição ocorrer a região promotora deve estar livre para se ligar a RNA polimerase (USP E-DISCIPLINAS, 2018). Contudo se sabe que o IPTG é tóxico a microorganismos causando estresse celular e lise em determinadas concentrações, além de seu custo ser acentuadamente maior ao da lactose (BANEYX, 1999). Figura 2- Indução IPTG Fonte: Scientific Figure on ResearchGate (2109). 1.1.4 Meio de Cultivo e nutrição bacteriana Os meios de cultivo fornecem os nutrientes necessários para que os microrganismos cresçam e as suas diferentes composições são construídas para atender às necessidades nutricionais de microrganismos específicos (TORTORA; CASE; FUNKE, 2017). 20 As condições ambientais e as composições nutricionais que bactérias são submetidas interferem no tamanho da população celular, assim conhecer as vias metabólicas utilizadas pelo microorganismo responsável por realizar a expressão proteica é essencial (TORTORA; CASE; FUNKE, 2017). Essa análise permite entender melhor o microorganismo e utilizar as melhores estratégias para realizar a fermentação e posteriormente a purificação, e assim otimizar o tempo, reduzir custos e obter o maior volume de produção do produto de interesse. Devido a E. coli ser o primeiro microrganismo geneticamente modificado da história sua fisiologia e metabolismo são vastamente estudadas (BOREM, SANTOS, 2008). O que torna possível criar estratégias de produção baseadas no que a bactéria necessita nutricionalmente, analisar os parâmetros ambientais e formas de enriquecer o meio, tudo isso buscando uma alta densidade celular (BASTOS, 2010). O meio de cultura pode ser classificado como definido quando todos os componentes químicos são conhecidos e mensuráveis ou classificado como complexo se compor de algum digesto biológico, como por exemplo o extrato de levedura, o que torna a composição química variável (TORTORA; CASE; FUNKE, 2017). Meios complexos, como o SB e TB, utilizam peptonas em sua formulação. Uma preocupação da Organização Mundial de Saúde (OMS) é em relação ao uso de peptonas de origem animal na produção de medicamentos injetáveis devido a possibilidade de possuírem Príons, peptídeos imunogênicos que estão relacionados a doença da vaca louca (WHO, 2003). Como alternativa existem peptonas de origem vegetal. Dentre os meios estudados no projeto estão o meio Luria Bertani (LB) e Semi Definido (SD), quais são vastamente utilizados em pesquisas de cinética de fermentação, os meios Super Broth e Terrific Broth (TB) que são utilizados para alcançar alta densidade celular (TRIPATHI et al., 2009). 21 2 OBJETIVOS Geral Avaliar as condições essenciais, em termos de nutrição, temperatura e custo/benefício dos indutores, para produção de L-Asparaginase em Escherichia coli BL21 (DE3). Específicos ● Avaliar diferentes meios de cultura para gerar maior produção celular e de L-asparaginase. ● Avaliar a necessidade de micronutriente no meio de cultura ● Adequar a formulação do meio complexo substituindo componentes de origem animal pelo de origem vegetal. Avaliar o comportamento cinético de produção bacteriano e de L- asparaginase em biorreator. 22 3 METODOLOGIA 3.1 Microrganismo O microrganismo utilizado é a Escherichia coli BL21 (DE3) construído com o vetor de expressão pET-28a, com promotor T7 e marcador de seleção de Canamicina. O gene utilizado neste trabalho está depositado no Gen Bank sobre o código: KY305877. A construção foi realizada pela Prof. Dra Gisele Monteiro - Faculdade de Ciencias Farmaceuticas - USP. 3.2 Banco de trabalho de células bacterianas O banco trabalho é formado a partir de clones de bactérias transformados, selecionados que expressam a L-asparaginase. Uma colônia com clone de expressão foi inoculado 50 mL em meio LB, submetido a agitação de 150 RPM, 37°C e quando DO600 nm atingiu 1,0 o cultivo foi finalizado, centrifugou assepticamente a 6.000 g por 10 minutos, descartou o sobrenadante e ressuspendeu em meio LB contendo 15% de glicerol. Alíquotas de 200 μL foram distribuídos em criotubos para congelamento a -20°C e depois armazenar em nitrogênio líquido a -150ºC. Visando garantir a integridade celular o glicerol é adicionado, para evitar que formem cristais que ocasionam a morte bacteriana (Vedoveli e Castro, 2016, p.39- 40). 3.3 Inóculo Para pré-inoculo foi utilizado 10 μL de alíquota (1,0 x 109 CFU/mL) do banco de trabalho em 50 ml de meio de cultivo com 30μg/mL de canamicina. Incubado em frasco Erlenmeyer de 300 ml por durante 15 horas em agitador rotativo a 300 rpm e 37ºC. 23 3.4 Cultivo Após o período overnight por meio do espectrômetro SHIMADZU UV 1800 foi realizada a medição da densidade ótica (DO600nm) para determinar o volume necessário para atingir DO inicial de 0,1, em 100 ml de meio de cultivo, com 60 μg/mL de Canamicina. Então assim como no inóculo, os experimentos são realizados sob incubação em shaker (New Brunswick, Innova 44), porém utilizando Erlenmeyer de 500 ml. 3.5 Expressão da proteína de interesse em frascos agitados O cultivo para expressão foi realizado assim como descrito no item 1.2 para acompanhar o crescimento bacteriano. A indução foi realizada quando a DO600 estava por volta de 3,0 e de acordo com o perfil de crescimento o cultivo se encontrava na metade da fase exponencial. O tempo de indução foi de 4 horas. Os indutores testados foram IPTG 1 mM e lactose 3 g/L em cultivos de autoindução. Enquanto o IPTG é adicionado ao cultivo no momento da indução, a lactose já está presente na composição do meio de cultura, porém a indução só se inicia quando a glicose se torna escassa no ambiente. Foram coletadas amostras, com intervalo de 1 hora entre elas, a partir de 1 hora antes da indução e durante todas as horas de indução. As amostras de cultura coletadas foram centrifugadas por 10 minutos a 9.000 rpm, a 5ºC, então o sobrenadante era desprezado e as células foram ressuspensas com 1 ml de salina 0,85%, homogeneizados com auxílio de vortex, centrifugadas novamente, o sobrenadante descartado e o precipitado celular foram acondicionados em freezer até o momento do uso. 3.6 Meios de Cultivo Nos experimentos em frascos agitados foram realizados experimentos com os meios Luria Bertani (LB), Semi definido (SD), Super Broth (SB), SB modificado e Terrific Broth (TB). 24 Tabela 1- Composição dos diferentes meios de cultura utilizados Componentes Meios Luria Bertani Terrific Broth Super Broth Super Broth Modificado Semi definido Extrato de levedura UF 5,0 24,0 24,0 24,0 1,0 Triptona 10,0 12,0 - - - NaCl 10,0 - - - - Soytone - - 12,0 12,0 - Glicerol* - - 5,0 - - Glicose - 5,0 - 10,0 10,0 K2HPO4 - 12,54 11,4 11,4 10,0 KH2PO4 - 2,31 1,7 1,7 13,0 MgSO4.7H2O* - 120g/L - - - - 16,67 [(NH4)HPO4] - - - - 3,0 (NaH2HPO4.H2O) - - - - 4,6 Solução de Micronutrientes B* - - - - 3,0 Fonte: Arquivo pessoal Componentes em g/L; * Componentes em ml/L. O meio SB foi projetado para obter alta densidade celular, o meio SB contém glicerol e possui Triptona em sua composição (TRIPATHI et al., 2009). No meio SB a Triptona foi substituída por Soytone e no meio SB modificado a glicose foi utilizada como fonte de carbono. O meio TB foi alterado, pois foi utilizada glicose ao invés de glicerol como dita o protocolo clássico com o propósito de formular o meio de autoindução. 3.7 Enriquecimento do meio TB modificado Foram realizados cultivos com meio TB modificado em presença dos micronutrientes conforme ilustrado na tabela 2 abaixo. 25 Tabela 2- Teste de avaliação em crescimento celular do meio TB modificado na presença dos micronutrientes MEIOS TB Soytone 12 g/L TB Soytone 17 g/L TB Soytone 17 g/L + Mg+2 mM TB Soytone 17 g/L + Fe+3 10 mM TB Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM TB Soytone 17 g/L + SO4-2 25 mM TB Soytone 17 g/L + Mg+2 20 mM Meio TB - Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM + MgCl2 2 mM Meio TB - Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM + MgSO4 15 mM Fonte: Arquivo pessoal. 3.8 Avaliação da fonte de carbono Neste experimento considerou o meio TB modificado (Soyotne 17 g/L) e nela realizou ensaios em diferentes concentrações de carboidratos conforme listado abaixo: 1. Glicose 3 g/L 2. glicose 5 g/L 3. glicerol 5 g/L 4. glicerol 10 g/L 5. glicerol 20 g/L 6. combinação das duas fontes de carbono: Glicose 5 g/L e glicerol 10 g/L Para o início do experimento a DO inicial foi ajustada para 0,1 e incubadas a 37ºC, 300 rpm. Amostragens foram realizadas a cada hora com coleta de amostra para medida de atividade enzimática. 3.9 Avaliação dos Indutores Meio de autoindução: O meio base nutriente foi o TB modificado contendo Soytone e combinação de dois carboidratos: glicose 5 g/L e glicerol 10 g/L e a 26 lactose como indutor foi testado em três concentrações 0,5, 1 e 3,0 g/L e adicionado ao meio no preparo. O experimento controle foi com IPTG 1 mM. Neste caso foi utilizado o meio TB modificado contendo soytone (17 g/L) e 5 g/L de glicose. A DO inicial foi ajustada para 0,1 e incubadas a 37ºC, 300 rpm. No momento em que DO600nm atingiu próximo de 3, 0 foi o início da indução com a adição de IPTG. Amostragens foram realizadas a cada hora para acompanhar o crescimento celular; foi coletado amostra momento antes da indução e a cada hora de indução no total de 4 horas. 3.10 Cultivo em Biorreator Foi utilizado biorreator de 1 litro (Multifors 2, INFORS HT) contendo 800 mL de meio de cultura. O pH foi controlado em 7,0 pela adição de hidróxido de sódio 5M quando necessário; a taxa de oxigênio dissolvido foi monitorado pelo sensor de pO2 e controlado a 30% utilizando o modo de cascata em que a agitação irá aumentar gradativamente quando a taxa de oxigênio diminuir de 30% e quando a agitação atingir o seu máximo ocorre a suplementação de oxigênio puro como segunda cascata. A temperatura foi mantida em 37°C através do termostato e banho de refrigeração conectado ao reator. A DO600nm inicial foi de 0,1 e amostras foram coletadas de hora em hora para verificar Densidade ótica, concentração de glicose (kit Bioclin), massa seca, e o sobrenadante para análises de carboidratos e ácidos orgânicos. Uma amostra antes da indução e aqueles pós indução foram coletadas para realizar os ensaios de atividade enzimática e eletroforese. 3.11 Procedimentos analíticos 3.11.1 Densidade Celular Através da medida da densidade ótica (DO600nm), realizada com auxílio de um espectrofotômetro foi avaliada a densidade celular. O intervalo de confiança para a leitura da DO600nm foi entre 0,1 e 0,5, sendo as amostras diluídas em salina 0,85% quando necessário. 27 3.11.2 Rompimento celular Para fins de análises de expressão da proteína por eletroforese e atividade enzimática, realizou-se o rompimento celular com auxílio da solução de lise BugBuster® que contém detergente aniônico da Novagen, e suplementado com Nuclease - Bezonase® 10 U e o fluoreto de a-fenilmetilsulfonila (PMSF) 100 µM. A Benzonase hidrolisa ácidos nucleicos, e juntamente com o detergente presente no Bugbuster contribui na lise celular e o PMSF é utilizado para que as proteases contidas no meio não degradem as proteínas inclusive a Asnase (NOVAGEN, 2000). 3.11.3 Determinação da atividade enzimática O método utilizado para a determinação da atividade enzimática da Asparaginase é aquele baseado no método de Nesslerização (IMADA et al., 1973). O método é realizado em duas etapas, sendo a primeira a reação enzimática (Figura 3) na qual a amostra contendo a ASNase é colocada na presença de seu substrato asparagina, a 37° C por 30 minutos e a ação enzimática é interrompida pela adição de TCA 25%. Controles e brancos também são conduzidos juntamente com a amostra, sendo que no controle a ASNase é inativada primeiro com a adição de TCA e depois recebe a asparagina. O controle serve para certificar que ação da asparaginase na amostra. A segunda etapa (Figura 4) é a revelação da atividade enzimática por colorimetria que é a Nesslerização, ocorre por meio da reação do reagente Nessler com a amônia, fruto da clivagem da asparagina, e forma um complexo amarelo claro (IMADA et al., 1973). A técnica é realizada de acordo com protocolo interno (Anexo A) do Laboratório de Desenvolvimento de processos do Instituto Butantan. Figura 3- Reação enzimática Fonte: Veras (2017). 28 Figura 4- Revelação da atividade enzimática por Nesslerização Fonte: Adaptado de Zhang et al (2018). Representação do que ocorre durante a reação com Nessler. 3.11.4 Determinação de massa seca Para a determinação da massa seca, 1 mL de amostras coletadas durante o cultivo foram dispostos em microtubo, previamente pesado em balança analítica, em triplicata. Após a distribuição das amostras nos tubos, estas eram centrifugadas por 10 minutos a 10.000 g, em seguida o sobrenadante foi transferido para outro tubo identificado e guardado -20°C para posterior análise quando necessário ou então descartados. O precipitado celular foi ressuspenso em 1mL de solução salina e novamente centrifugados nas mesmas condições que a primeira rodada. Os sobrenadantes descartados e o precipitado celular colocados em estufa a 60°C por 24 horas ou até que houvesse a desidratação completa e depois disso eram pesados. Então é realizada a pesagem dos microtubos e através da diferença desse valor e o peso do microtubo é obtida a massa seca (MS). E por meio da divisão entre MS e volume de cultura foi obtida a concentração (g/L). 3.11.5 Análise de carboidratos e acetato Amostras a cada hora de cultivo coletadas foram centrifugadas a 9.000 rpm por 10 minutos; separado o sobrenadante, qual foi então acondicionado em freezer até o momento de uso. Para análise as amostras foram diluídas 5 vezes utilizando solução de ácido sulfúrico 50 mM e filtradas (filtro Merck.co, poro 45 µm de diâmetro) para os tubos. 29 A análise foi realizada em UHPLC Ultimate 3000 (Thermo scientific) composto por detector UV (210 nm) para medidas de ácidos orgânicos e índice de refração (RefractoMax 520) para os carbohidratos. A coluna utilizada foi Aminex HPX 87-H (Biorad) e ácido Sulfúrico 5 mM como fase móvel com vazão 0,6 ml/ min a 50ºC. Foram medidos glicose, glicerol, lactose e acetato e a determinação das concentrações foi realizada através do software Chromeleon 7.0 para a integração dos cromatogramas. Para a quantificação foi realizada curva de calibração com pool de carboidratos e de ácidos orgânicos - padrão da Biorad. 3.11.6 Eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) A técnica de eletroforese é qualitativa e com ela é possível analisar a o tamanho molecular das proteínas presentes. Para os experimentos as amostras utilizadas foram de 1 ponto anterior a indução, para controle, todos os pontos induzidos. Para realizar o experimento foi utilizado o protocolo que se encontra no apêndice. A técnica é realizada de acordo com protocolo interno (Apêndice B) do Laboratório de Desenvolvimento de processos do Instituto Butantan. 3.12 Velocidade específica máxima de crescimento Através dessa função matemática é possível representar o crescimento de uma população microbiana. A relação entre o logaritmo Neperiano de biomassa e tempo de cultivo resulta em uma reta da qual a inclinação se transmite o valor do µmax h-1(HISS, 2013; SANTOS, 2017). 30 Equação 1: velocidade específica máxima de crescimento 𝑙𝑛 𝑋𝑡 = 𝑙𝑛𝑋𝑜 + µ𝑥(𝑡 − 𝑡𝑜) Xt = Biomassa final para um determinado tempo Xo = Biomassa inicial do cultivo (t-to): intervalo de tempo µ𝑥: Velocidade específica máxima de crescimento Fontes: Santos (2017). 3.13 Análise de custos - indutores Para a análise de custo/benefício dos indutores considerou-se inicialmente os preços de cada um deles, a quantidade necessária de cada um dos indutores por litro de cultivo. Quantidade necessária dos indutores por litro de cultivo em frascos agitados: IPTG- a concentração de trabalho é de 1 mM - para 1 litro de cultivo utiliza - 0,25g. Lactose- 3 gramas por litro de cultivo. Tabela 3- Custo dos Indutores Indutores R$/frasco R$/L US$/L* IPTG - I6758-1G* 255,00 63,75 15,10 Lactose.1H2O- 61345-1KG 319,00 0,957 0,23 Fonte: Adaptado Sigma (2020). Tabela realizada com cotação do dólar a 4,22 reais em 28/01/2020. 31 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Avaliação dos meios complexos A primeira etapa do projeto foi avaliar os diferentes meios de cultivo complexos selecionados para maior densidade celular e atividade enzimática. O gráfico 1A ilustra os perfis de crescimento celular nos meios utilizados, o meio SB foi o que apresentou o menor comportamento em relação ao crescimento chegando ao DO600nm final ao redor 4,0 ao final da décima segunda hora; já o meio semi definido SD e LB demonstram um perfil de crescimento bastante similar, com uma leve vantagem para o meio LB atingindo DO600nm final de 4,0 e 2,50 respectivamente. O SB modificado e TB obtiveram as maiores taxas de densidade celular no mesmo período de tempo de fase exponencial, sendo o TB melhor com DO600nm final de 8,0 mediante 6,5 de SB modificado. No meio SB modificado foi utilizado glicose, essa é consumida mais rapidamente que o glicerol e por isso gera uma maior população bacteriana quando comparada ao meio SB contendo glicerol. Contudo os metabólitos gerados pela glicose acidificam o meio e então a capacidade de tamponamento do meio é superada e o crescimento celular é afetado. Em comparação com SB modificado, meio com segunda maior densidade celular máxima, o TB possui uma maior concentração de compostos tamponantes e menor de glicose. A menor concentração de glicose gera menor excreção de metabólitos acidificantes e a maior concentração de tampões permite o pH estabilizado por maior tempo, esses fatores contribuem para que não ocorra estresse bacteriano e não tenha interferência na produção enzimática. Pelo Gráfico 1 é perceptível que a população bacteriana no meio TB foi ligeiramente superior que o meio SB modificado. O meio TB testado apresenta triptona como um dos componentes complexos ao invés de soytone e glicose como fonte de carbono. Muito provável que a diferença apresentada em crescimento celular seja devido a quantidade de nitrogênio total presente na triptona ser superior que em soytone (BD BIOSCIENCES, 2006). 32 Gráfico 1- Perfil de crescimento de diferentes meios complexos Fonte: Arquivo pessoal do autor. . Para avaliar a expressão de ASnase foi necessário realizar um cultivo com indução através da introdução de IPTG 1 mM quando a DO600 estava por volta de 3. Quando ocorre a indução a velocidade de crescimento dos microorganismo é diminuída devido a alteração das vias metabólicas que ocorrem para se iniciar a síntese da enzima de interesse (ANDERSEN; VON MEYENBURG, 1980). Na tabela 4 é exposto que assim como no perfil de crescimento vemos que os meios LB e SD tem níveis de atividade muito próximos, o meio SB tem uma expressão lenta e gradativa. Já o meio SB Mod. tem atividade baixa em relação ao perfil de crescimento apresentado. O meio TB tem um perfil de expressão condizente ao perfil de crescimento que apresenta a maior concentração de ASNase dentre os meios avaliados. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D O 6 0 0 n m Tempo (h) LB SD TB SB Modificado SB 33 Tabela 4- Atividade enzimática em diferentes meios complexos - indução com IPTG 1mM Meios Atividade enzimática - UI/mLc 1h 2h 3h 4h 5h 6h LB 1,495 2,260 2,615 3,122 - - SD 1,917 2,191 2,781 3,660 - - SB * 0,235 2,570 3,045 - - - SB Mod. - - 2,981 1,527 2,545 3,53 TB 0,000 3,710 5,150 6,850 7,810 10,350 Fonte: Arquivo pessoal *Meio só teve 3 horas de indução. Na tabela está exposto, em UI/ml de cultivo É possível observar que tanto pelo Grafico 1, perfis de crescimento celular, quanto pelos dados de atividade enzimática (Tabela 3) são explícitos a superioridade dos resultados obtidos utilizando meio TB. O valor da 6a hora de indução do TB é 300 % maior que o do SB, segundo meio com melhor produtividade (Tabela 4). Também é possível verificar através da atividade enzimática (Tabela 4) que quanto mais nutricionalmente limitado o meio, LB e SD, menor era a produção da L- asparaginase. Apesar de todos serem meios complexos o meio TB é o que contém a maior concentração de peptona e de compostos tamponantes que os restantes, esse aspecto influência nos resultados obtidos. Os resultados mostraram que o meio TB se mostrou o melhor e devido a isso ele foi o escolhido para experimentos da próxima etapa. 4.2 Avaliação de peptona de origem vegetal e micronutrientes no meio TB A OMS recomenda substituir o uso de componentes de origem animal pelo de origem vegetal por uma eventual possibilidade de Príons, peptídeos imunogênicos que estão relacionados a doença da vaca louca (WHO, 2003). Dois produtos foram verificados: Hy-Soy 4D e Soytone Bacto. A análise foi feita através das informações cedidas pelos fabricantes no certificado de análise (GUPTA, 2015; BD BIOSCIENCES, 2006). 34 As peptonas são utilizadas principalmente por serem grandes fontes de nitrogênio e por isso o componente mais relevante na análise foram os aminos ácidos livres. O Hy-Soy 4D apresenta 56 mg/g de amino nitrogênio livre enquanto o Soytone tem 94 mg/g. Deste modo o Soytone foi o componente selecionado para substituir a Triptona. Foram realizados cultivos em frascos agitados com meio TB modificado com 12 g/L de Soytone. A tabela 5 mostra os valores da densidade optica (OD600nm) e a velocidade específica máxima de crescimento (µmax h-1) comparando o meio TB modificado com Soytone e o meio TB com triptona. Nota-se que a substituição gerou uma diminuição no crescimento celular e na velocidade específica de crescimento máxima. Tabela 5- Comparação dos parâmetros cinéticos obtidos utilizando Triptona (origem animal) e Soytone (origem vegetal) Meios µmax h-1 OD600nm (UA)* TB Triptona 12 g/L 1,137 8,05 TB Soytone 12 g/L 0,947 6,85 Fonte: Arquivo pessoal. *Valor máximo de DO600 atingida durante o cultivo. Ao fazer o balanço da quantidade de nitrogênio total presente em soytone e em triptona foi constatado menor quantidade de nitrogênio em Soytone (Tabela 6). Assim foi realizado o balanceamento químico para que houvesse a mesma concentração de aminoácido livre em Soytone da presente em 12 g/L de Triptona (Tabela 7), em consequência foi preciso aumentar para 17 g/L de Soytone. Nesta composição verificou que tanto o crescimento celular como a velocidade específica máxima de crescimento (Tabela 7) ficaram muito próximo ao do TB original contendo triptona. 35 Tabela 6- Tabela de análise química Soytone Produto Nitrogênio Total (%) Amino Nitrogênio (%) Triptona 13,3 4,5 Soytone 9,4 3,1 Fonte: Adaptado BD (2006). Tabela 7- Comparação dos parâmetros cinéticos obtidos utilizando Triptona (origem animal) e Soytone enriquecido (origem vegetal) Meios µmax h-1 OD600nm (UA)* TB Triptona 12 g/L 1,137 8,053 TB Soytone 12 g/L 0,947 6,847 TB Soytone 17 g/L 1,044 7,696 Fonte: Arquivo pessoal. *Valor máximo de DO600 atingida durante o cultivo. O meio TB modificado com Soytone na concentração de 17 g/L foi utilizada para os próximos ensaios, ie, o da avaliação de micronutrientes. Em estudo de análise teórica da concentração de micronutrientes contidos na peptona vegetal (soytone) foi verificado os benefícios da suplementação de 3 micronutrientes que seriam interessantes para enriquecer o meio sendo esses Magnésio, Ferro e Sulfato. Segundo Studier (2005) as concentrações desejadas para o crescimento de Escherichia coli são: 5 a 500 mM de Ferro, 2 a 20 mM de Magnésio e cerca de 25 mM de Sulfato. Após balanceamento químico os meios foram enriquecidos e como é mostrado na tabela 8 não demonstraram nenhuma mudança significativa na biomassa celular e na velocidade específica máxima de crescimento. Os meios enriquecidos com Mg+2 2 mM, Fe+3 10 mM e Fe+3 2 mM + Mg2SO4 15 mM alcançaram resultados muito similares ao TB modificado com somente Soytone, porém para justificar o enriquecimento era necessário que o meio enriquecido com 36 micronutriente superasse em densidade celular o meio modificado com Soytone o que não ocorreu. Tabela 8- Modificações do meio TB Meios µmax h-1 DO600nm (UA)* TB Soytone 17 g/L 1,044 7,696 TB Soytone 17 g/L + Mg+2 2mM 1,012 7,486 TB Soytone 17 g/L + Mg+2 20 mM 1,005 7,236 TB Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM 0,843 7,077 TB Soytone 17 g/L + Fe+3 10 mM 1,017 7,497 TB Soytone 17 g/L + SO4 -2 25 mM 1,267 6,699 TB- Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM + MgCl2 2 mM 0,619 6,601 TB- Soytone 17 g/L + Fe+3 2 mM + Mg2SO4 15 mM 0,741 7,564 Fonte: Arquivo pessoal. *Valor máximo de DO600 atingida durante o cultivo. Após os experimentos foi verificado a capacidade do Soytone de substituir com sucesso a triptona e manter a produtividade semelhante. Quanto ao enriquecimento com micronutrientes foi verificado que esses não melhoraram a biomassa celular. 4.3 Avaliação das fontes de carbono Tendo em vista quão essencial são as fontes de carbono para o funcionamento regular celular e por consequência a síntese correta da proteína de interesse é vista a importância de analisar os tipos e concentrações de fonte de carbono contidas no meio de cultura. O meio TB modificado (Soyotne 17 g/L), qual mostrou os melhores resultados no Screening, foi utilizado nessa etapa para realizar o cultivo e testar os carboidratos glicose e glicerol. A glicose é o carboidrato de primeira escolha, sendo rapidamente absorvido e por isso proporciona um rápido crescimento celular, as concentrações testadas foram de 3 e 5 g/L. O glicerol é um carboidrato que exige mais etapas para ser 37 metabolizado, sua absorção é mais lenta o que ocasiona menor produção de metabólitos ácidos, as concentrações testadas foram 5, 10 e 20 g/L. No gráfico 2 é possível perceber que a concentração de 5 g/L de glicose alcançou biomassa celular substancialmente maior que 3 g/L. Já no perfil de crescimento baseado em glicerol demonstrado no gráfico 2 é visto que a diferença no perfil de crescimento é mínima entre as concentrações testadas. Gráfico 2-Cinética com diferentes concentrações de glicose e glicerol. Fonte: Arquivo pessoal do autor. Logo a concentração de glicose 5 g/L impulsionou o crescimento e acelerou o aumento da população bacteriana, enquanto o glicerol manteve a taxa de crescimento em todas as concentrações. Visando proporcionar fonte de carbono por mais tempo de cultivo se for necessário a concentração intermediária de glicerol, 10 g/L, foi escolhida para compor o meio. Para analisar como se comportaria o perfil de crescimento com as duas fontes de carbono compondo o meio foi realizado um cultivo onde o meio TB modificado utilizado continha glicose 5 g/L e glicerol 10 g/L. Essa estratégia é utilizada para conseguir uma quantidade substancial de biomassa, pois a glicose proporciona um rápido crescimento celular e depois que essa se torna escassa o glicerol é fonte de alimento ao longo do cultivo. 38 No gráfico 3 é possível visualizar que o cultivo com a combinação de carboidratos possui um leve aumento da biomassa celular e uma fase exponencial de maior período quando comparado ao meio que continha apenas glicose. Gráfico 3- Perfil de crescimento bacteriano na presença de glicose, glicerol e glicerol+glicose Fonte: Arquivo pessoal Devido a glicose produzir metabólitos que acidificam o meio, condição limitante para expressão proteica, seu uso em conjunto com o glicerol que produz mais lentamente tais metabólitos é uma estratégia viável para prolongar o crescimento bacteriano ora usando uma fonte de carbono de consumo rápido, glicose, e ora usando uma fonte de carbono de lenta absorção (ANDERSEN; VON MEYENBURG, 1980). Logo o meio TB modificado e acrescido de glicerol 10 g/L foi considerado o melhor para uso em cultivo para produção de ASNase. 4.4 Avaliação dos indutores Foram testados dois indutores, IPTG e Lactose, analisando biomassa celular, atividade enzimática e o custo do processo considerando os preços dos indutores. Diversas pesquisas buscam usar a lactose como uma alternativa menos nociva e mais barata, pois se sabe das propriedades tóxicas do IPTG o que é 39 agravado no caso de um biofármaco injetável (ANDERSEN, 1980; GOMBERT, 1998). Foram testadas diferentes concentrações de Lactose, 0,5; 1 e 3 g/L, para verificar se haveria limitação destes pelo microorganismo. Os cultivos foram realizados em frascos agitados com meio TB modificado sem adição de glicose e glicerol, para verificar o perfil de crescimento enriquecendo apenas com Lactose. Como exposto Gráfico 4A o crescimento celular mais expressivo foi com 3 g/L de lactose e esse foi selecionado para usar como indutor. No experimento comparando os dois indutores (Gráfico 4B), IPTG 1 mM (I) e lactose 3 g/L (L), se concluiu que a velocidade de crescimento é maior em IPTG, porém a biomassa máxima é maior em Lactose, contudo é perceptível que o perfil de crescimento celular de ambos é semelhante. Na atividade enzimática o cultivo induzido com IPTG mostra uma maior expressão da enzima de interesse, porém no último ponto de indução os dois indutores se assemelham. Gráfico 4- Avaliação de indutores. A- Perfil de crescimento bacteriano em presença de lactose. B- Perfil de crescimento bacteriano em presença de IPTG 1 mM comparado a Lactose 3 g/L e atividade enzimática representada (colunas). Fonte: Arquivo pessoal Apesar dos perfis de crescimento bacteriano serem semelhantes, na atividade enzimática. Apesar dos perfis de crescimento bacteriano serem semelhantes, na atividade enzimática utilizando o IPTG como indutor mostra desde o início alto nível diferente da lactose em que o perfil de atividade enzimática vai aumentando gradativamente até quase se igualar com o IPTG no último ponto da indução. Foi 40 realizada uma análise de custo considerando os preços dos indutores para identificar qual o que demonstra melhor custo benefício (Tabela 9). Para a análise de custo levou em consideração o preço dos indutores e quantidade utilizada de cada um nos experimentos. A Tabela 9 mostra, que o custo por do IPTG é 65 vezes maior ao da lactose. Tabela 9- Comparação de custo dos indutores por litro de cultivo Indutor Preço por litro de cultivo (US$) IPTG (Sigma) 15,10 Lactose.H2O (Sigma) 0,23 Fonte: Adaptado Sigma (2020). Sendo que no último ponto da atividade o IPTG é 17% maior que a lactose, entretanto considerando o custo da lactose por litro de cultivo é 60 vezes mais em conta que o IPTG além deste ser tóxico. A Lactose é o indutor com maior custo/benefício e será testado nos cultivos em Biorreator. 4.5 Cultivo em Biorreator Após os ensaios preliminares em frascos agitados para selecionar e customizar o meio complexo adequado para fins de produção do biofármaco L- Asparaginase, realizou-se os cultivos em biorreatores para avaliar os parâmetros cinéticos de produção tanto do microorganismo como da L-asparaginase. Como em biorreatores as condições são melhor controladas seja pelo controle de pH, adição de substrato ou mesmo a introdução de oxigênio na forma de ar comprimido ou ainda enriquecer com o oxigênio puro, as quantidades das fontes de carbonos foram aumentadas, assim o meio para o reator foi o TB modificado contendo Soytone 17g/L, glicerol 25 g/L e lactose 7 g/L. 41 A DO600nm máxima alcançada foi de 34,55 mostrando um aumento significativo em relação ao frasco agitado (DO600nm ~7,7). No gráfico 5 podemos verificar o aumento da biomassa ao longo do cultivo, o consumo da glicose que ao ficar escassa no meio, próximo da 9a hora de cultivo, se nota o consumo de Lactose e glicerol. A atividade enzimática começa a ser expressa quando a metabolização da lactose se inicia (9ah de cultivo) e chegando nos últimos pontos a atividade enzimática de 28 UI/ml de cultivo e estacionando nesse valor coincidentemente quando a lactose e o glicerol são totalmente consumidos. Gráfico 5- Parâmetros cinéticos do cultivo em batelada de Escherichia coli BL21(DE3) pET28 ASNase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 2 4 6 8 10 12 14 m a s s a s e c a ( g /L ) Tempo (h) 0 2 4 6 8 g lic o s e ( g /L ) 0 5 10 15 20 25 30 g lic e ro l( g /L ) 0 2 4 6 a c e ta to ( g /L ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 a ti v id a d e ( U I/ m L c ) 0 2 4 6 8 l a c to s e ( g /L ) Fonte: Arquivo pessoal. Para analisar se seria possível aumentar a produtividade de ASNase aumentando a concentração da Lactose como indutor foi realizado um segundo cultivo em biorreator. Neste foi realizada alimentação de Glicerol e Lactose individualmente. É visto no Gráfico 6 que a biomassa celular e atividade enzimática se mantiveram nas mesmas taxas que ao cultivo anterior, tendo que a atividade enzimática se manteve estável durante o período de indução. 42 É ainda possível verificar que a concentração de glicerol se manteve ao redor de 9 g/L, no entanto a lactose foi sendo consumida no decorrer do cultivo e nas últimas horas estava ~0,5 g/L. Sendo assim ainda fica a questão se a lactose não está sendo limitada para que não aumente a atividade enzimática. Gráfico 6- Parâmetros cinéticos do cultivo em batelada alimentada de Escherichia coli BL21(DE3) pET28 ASNase 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 m a s s a s e c a ( g /L ) Time (h) 0 2 4 6 8 g lic o s e ( g /L ) 0 2 4 6 8 10 12 14 g lic e ro l( g /L ) 0 1 2 3 4 5 6 A c e ta te Tempo (h) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 a ti v id a d e ( U I/ m L c ) 0 2 4 6 l a c to s e ( g /L ) Fonte: Arquivo pessoal. Com a alíquota obtida dos cultivos foi realizada eletroforese a fim de complementar a avaliação da expressão de ASNase. Na figura 5 temos o gel SDS- PAGE dos dois cultivos em biorreator, nos dois casos é visto que nas amostras NI (não induzido) e 1h não aparece banda na região da ASNase, isso é devido a nenhuma ou pequena taxa de expressão nesses momentos. Nas horas seguintes a banda aprece vivida e constante por todas as horas de indução 43 Figura 5- SDS-PAGE cultivos em biorreator Fonte: Arquivo pessoal. Nos dois cultivos é observada que apenas após os meios se tornarem deficientes em glicose é que o glicerol e a lactose começam a ser consumidos. Isso ocorre devido a glicose ser a primeira escolha do microorganismo para produção de ATP, e a lactose e glicerol são metabolizadas de modo mais lento. O acetato é o metabólito gerado durante o consumo de carboidratos e pode inibir o crescimento celular dependendo da concentração e afetar na expressão de proteínas. A formação de acetato em presença de glicerol é menor (ANDERSEN; VON MEYENBURG, 1980). 44 5 CONCLUSÕES Na primeira etapa do projeto foi realizado a seleção do meio complexo a ser utilizado no decorrer deste trabalho; foi verificado que o meio Terrific Broth alcançava maior produção em biomassa (7,7 UA). Modificações no meio TB foram realizadas para garantir o melhor desempenho e qualidade deste para ser utilizado na produção que apresenta requerimento quanto a regulatórios para produtos injetáveis. Assim, a triptona, componente do meio TB original, cuja a origem é animal, foi substituída pelo soytone (origem vegetal); a quantidade deste foi adequada para apresentar valor de biomassa próximo ao da triptona. Na nova formulação do TB, com soytone, verificou que não alteravam de forma significante o crescimento bacteriano. A combinação das fontes de carbono glicose e glicerol contribui no melhor e maior crescimento bacteriano, isto é, na presença de glicose o microorganismo cresce mais rápido e quando este acaba inicia-se o consumo do glicerol cuja a velocidade é menor, mas atinge uma DO600nm por não gerar acetato a nível de causar inibição. Foi ainda observado que é possível utilizar lactose como indutor ao invés do IPTG, com a vantagem de adicionar a lactose na formulação do meio, sendo assim um meio de auto-indução, desde que estejam presentes no meio glicose e glicerol. Pela análise de custo realizada considerando somente os indutores verificou que a lactose apresentou maior custo/benefício em relação ao IPTG sendo este 65 vezes mais caro, além de ser tóxico. Ensaios realizados em biorreator gerou maior biomassa pelo fato das condições de aeração, nutrientes são melhor controladas, além da possibilidade de ajustar o pH e resultou na produção bacteriana de 39,9 UA e atividade enzimática de 29,21 UI/ml de cultivo. Outros estudos serão necessários para verificar por quanto tempo de indução a produção da Asparaginase será mantida e verificar a qualidade da enzima, se há degradação da enzima durante esse período, experimento em biorreator utilizando IPTG como indutor para corroborar se a lactose realmente é o indutor com melhor custo benefício. 45 REFERÊNCIAS ANDERSEN, Klaus B.; VON MEYENBURG, Kaspar. Are growth rates of Escherichia coli in batch cultures limited by respiration?. Journal of bacteriology, v. 144, n. 1, p. 114-123, 1980. BANEYX, François. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in biotechnology, v. 10, n. 5, p. 411-421, 1999. BASTOS, Reinaldo Gaspar. 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